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冷凍保存細(xì)胞之方法？

冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ （-20 ℃30 分鐘*） → -80 ℃16~18 小時(shí)（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。*-20 ℃不可超過(guò)1 小時(shí)， 以防止冰晶過(guò)大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過(guò)此步驟直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)及說(shuō)明：

1．本方法適用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，而不適用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，懸浮細(xì)胞可使用滴片法；

2．所使用的蓋玻片應(yīng)該為優(yōu)質(zhì)玻璃，并經(jīng)過(guò)鉻酸洗液處理；

3．蓋玻片非常薄，易碎，取放蓋玻片時(shí)動(dòng)作要輕；

4．如果需要更多生長(zhǎng)狀態(tài)一致的細(xì)胞，可以使用較大的培養(yǎng)皿，但不宜過(guò)大，以避免培養(yǎng)液的浪費(fèi)和增加污染機(jī)率；

5．如果細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)能力較差，可將蓋玻片在0.5%多聚賴氨酸溶液中浸泡5-10分鐘并自然晾干。

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無(wú)菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，將成1mm3左右大小；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過(guò)夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

甲型流感 H4N4 (A/mallard duck/Alberta/299/1977) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) (變性)

大鼠 IL9R / Interleukin 9 receptor 細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) (變性)

甲型流感 H1N1 (A/Beijing/22808/2009) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) (變性)

甲型流感 H12N1 (A/mallard duck/Alberta/342/1983) 血凝素HA1 (Hemagglutinin) 細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) (變性)

甲型流感 H6N4 (A/chicken/HongKong/17/77) 血凝素HA1 (Hemagglutinin) 細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) (變性)

甲型流感 H5N1 (A/Cambodia/S1211394/2008) 血凝素HA1 (Hemagglutinin) 細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) (變性)

甲型流感 H4N8 (A/chicken/Alabama/1/1975) 血凝素HA1 (Hemagglutinin) 細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) (變性)

甲型流感 H4N4 (A/mallard duck/Alberta/299/1977) 血凝素HA1 (Hemagglutinin) 細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) (變性)

小鼠 CD55 / DAF 細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) (變性)

 NGFR/ P75 細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) (變性)

大鼠神經(jīng)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞N-甲基-N-基硅烷三氟乙酰 GC，≥98.5%鐵 99.99% metals basisIntegrin alpha 1  整合素α1抗原

N-甲基-N-基硅烷三氟乙酰 95%還原鐵粉 AR，100目Integrin Alpha4 Beta7/LPAM-1 (Lymphocyte Peyer’s patch Adhesion Molecule 1/Integrin alpha4,beta7)  整合素α4β7抗原

炔酸甲酯 97%還原鐵粉 CP，100目Integrin AlphaE2/CD103  整合素αE2抗原

4-甲基-3-硝基吡 97%還原鐵粉 98%，400目ENPP3/CD203c(ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 3)  ENPP3抗原

2-甲基-3-丁炔-2- 98%鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液1.19-1.35mg/L,用于水分析IQGAP1  支架蛋白抗原

3-甲氧基苯基酸 97%納米鐵粉 99.9%，50nmIRF-1(Interferon regulatory factor-1)  干擾素調(diào)節(jié)因子抗原

4-甲氧基苯基酸 97%納米鐵粉 99.9%，80nmIRAK 2(IL-1 Receptor-associated Kinase 2)  白介素-1受體相關(guān)激2抗原

N-甲基-N-(基硅基)乙酰 97%苯乙酮 GCS,≥99.5% (GC)IL-1RA (Interleukin-1 receptor antagonist)peptide  白介素-1受體拮抗劑抗原